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糖尿病胃輕癱大鼠的造模方法探討

時間:2021-01-20作者:宋亞玲 黃舉凱 叢佳林
本文導讀:這是一篇關于糖尿病胃輕癱大鼠的造模方法探討的文章,糖尿病胃輕癱(diabetic gastroparesis, DGP)是糖尿病自主神經病變的常見類型,指由糖尿。╠iabetes mellitus, DM)引發的胃腸道動力障礙,臨床主要表現為餐后脹滿、惡心嘔吐、食欲下降、腹痛等。

  摘    要: 目的 探討糖尿病胃輕癱(diabeticgastroparesis,DGP)大鼠的造模方法。方法 從70只正常SD雄性大鼠中隨機選擇60只高脂高糖飼養2周后,禁食、自由飲水12h,腹腔注射溶于檸檬酸鹽緩沖液的鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ)50mg/kg建立糖尿病大鼠模型。從50只糖尿病大鼠中隨機選取10只高脂高糖飲食喂養8周,設為DGP模型組。余10只健康SD大鼠普通飼料飼養2周后腹腔注射等劑量檸檬酸鹽緩沖液普通飼料喂養8周,設為對照組。檢測造模期間大鼠血糖、體重變化及胃腸動力指標。結果 與正常組相比,模型組造模后空腹血糖顯著增加(P<0.01),8周后體重明顯下降(P<0.01),胃殘留率增加(P<0.05),小腸推進率顯著降低(P<0.01)。結論 在腹腔注射STZ配合高脂高糖飼養誘導SD大鼠形成糖尿病基礎上,高脂高糖喂養可構建DGP大鼠模型。

  關鍵詞: 糖尿病胃輕癱; 動物模型; 鏈脲佐菌素; 高脂高糖飲食;

  Abstract: Objective To explore the method of establishing the diabetic gastroparesis (DGP) rat model . Methods Sixty rats were randomly selected from seventy healthy SD male rats as model group which were fed with high-fat and high-sugar diet for 2 weeks,After being fasted and freely drinking water for 12h,they were injected intraperitoneally with streptozotocin (STZ soluble in 0.1mol/L citric acid buffered salt solution) 50mg/kg to establish diabetic rat model. Fasting blood glucose ≥13.9mmol/L after 72h indicated that the diabetic animal model was successfully induced. From the fifty SD rats with successful diabetic model, ten rats were randomly selected to feed on the high-fat and high-sugar diet for 8 weeks to establish DGP animal model. Ten healthy SD male rats in the control group were fed for 2 weeks. After being fasted and freely drinking water for 12 h, they were injected intraperitoneally with equivalent dosage of sodium citrate buffer and then fed with ordinary diet for 8 weeks as normal control group.During the experiment, the general condition, body weight and blood glucose of the both groups of rats were observed, the gastric residual rate and small intestine advancing rate were measured after the rats were sacrificed. Results Compared with the normal group, the fasting blood glucose of the model group was significantly increased after modeling (P<0.01), the rats were thinner,body weight and small bowel propulsion rate (P<0.01)were significantly reduced, whereas the gastric residue rate was significantly increased (P<0.01,P<0.05)after 8 weeks in the model group. Conlusion Intraperitoneal injection of STZ 50mg/kg combined with high-fat and high-sugar diet fed SD rats for 8 weeks can successfully induce DGP rat model which can provide the simple modeling method for animal experimental study of DGP.On the basis of intraperitoneal injection of STZ 50mg/kg combined with high-fat and high-sugar feeding SD rats to build the diabetes model, the diabetic rats model that were continued to feed high-fat and high-sugar diet for 8 weeks can successfully establish the DGP rat model, which is a simple and convenient modeling method.

  Keyword: Diabetic gastroparesis; Animal model; Streptozotocin; High-fat and high-sugar diet;

  糖尿病胃輕癱(diabetic gastroparesis, DGP)是糖尿病自主神經病變的常見類型,指由糖尿。╠iabetes mellitus, DM)引發的胃腸道動力障礙,臨床主要表現為餐后脹滿、惡心嘔吐、食欲下降、腹痛等。研究發現,1型糖尿。╰ype 1 diabetes mellitus,T1DM)患者27%~65%存在胃排空延遲,2型糖尿。╰ype 2 diabetes mellitus,T2DM)患者胃排空延遲發病率達30%。胃輕癱在T1DM患者中似乎比T2DM患者更為普遍,然而T2DM較高的患病率,使得T2DM胃輕癱患者臨床也較為常見[1]。DGP可影響營養物質和口服藥物的吸收利用,干擾血糖控制,增加住院率及死亡風險[2]。當前DGP發病機制尚未完全明了,診療效果有限。建立科學合理的動物模型在探討疾病發病機制、病理改變及臨床療效評估等方面可發揮重要作用。

  1、 實驗材料

  1.1、 實驗試劑及飼料

  鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ, Sigma公司,批號:S0130)。0.1mol/L檸檬酸緩沖鹽溶液(Solarbio,批號:C1013)。普通飼料由北京中醫藥大學動物中心提供。高脂高糖飼料(脂質45%、碳水化合物35%、蛋白質20%)購自北京華阜康生物科技股份有限公司[SCXK(京)2015-0015]。

  1.2、實驗動物

  健康雄性SD大鼠70只,體重230~250g,購于斯貝福(北京)生物技術有限公司[SCXK(京)2019-0010]。分籠喂養于北京中醫藥大學無特定病原體(Specific pathogen Free,SPF)級實驗動物中心,實驗溫度為(25±2)℃、相對濕度60%~70%,間斷光照,自然通風,自由飲水。

  2 、實驗方法

  2.1 、模型建立及給藥方案

  從70只健康SD雄性大鼠中隨機選擇60只高脂高糖飲食飼養2周,禁食、自由飲水12 h后腹腔注射1% STZ 50mg/kg(STZ溶于pH 4.5的0.1mol/L檸檬酸鹽緩沖溶液,配置濃度為10mg/mL),此操作需在10 min內注射完成。72 h后采用葡萄糖氧化酶法測尾靜脈血糖值,參考相關文獻以空腹血糖≥13.9mmol/L提示糖尿病大鼠模型誘導成功[3]。共誘導形成50只SD糖尿病大鼠,成模率為83.3%。從糖尿病模型復制成功的SD大鼠中隨機選擇10只予高脂高糖飲食飼養8周,設為模型組。余10只健康雄性SD大鼠設為正常組,普通飲食飼養2周后,隔夜禁食、不禁水,腹腔注射等量的0.1mol/L檸檬酸鹽緩沖液,72 h后檢測尾靜脈血糖水平,后以普通飼料飼養8周。兩組大鼠實驗期間均自由飲水。

  2.2 、觀察指標

  2.2.1、 一般狀況

  動態監測造模期間兩組大鼠的健康狀況、飲食活動、皮毛、二便排泄量、性狀和死亡情況等,每2周稱重1次,記錄體重情況。

  2.2.2 、血糖檢測

  兩組大鼠分別在造模前和造模后第3天、1周、3周各禁食、自由進水12h后,采集尾靜脈血使用One-Touch血糖儀檢測空腹血糖值。若血糖水平超過33.30 mmol/L則高于血糖儀可檢測范圍上限。為便于數值分析,將超出可檢測高限的血糖值指定為最大可檢測水平33.30 mmol/L。第8周大鼠空腹血糖水平通過動物取材時采集腹主動脈血經自動生化分析儀檢測。
 

糖尿病胃輕癱大鼠的造模方法探討
 

  2.2.3、 大鼠胃殘留率

  兩組大鼠禁食、自由飲水16h后,灌入2mL半固體炭墨糊。30min后10%水合氯醛麻醉大鼠,剖開腹腔,腹主動脈采血后在4℃條件下3500 r/min離心15min,留存上清液,使用自動生化儀檢測大鼠血清血糖水平。采血完成后,用手術縫合線在鼠胃的賁門和幽門部位打結,分離摘除胃組織后稱量胃全重,之后沿胃大彎剖開,用生理鹽水沖洗去除殘余炭墨并用濾紙擦拭干凈后稱取胃凈重,計算胃殘留率% ([胃全重(g)-胃凈重(g)]/炭墨糊重(g)×100%)。

  2.2.4 、大鼠小腸推進率

  將大鼠幽門至直腸末端全部取出,不附加外力牽拉,自然平放于實驗操作平臺,測量炭墨前端至幽門的距離,測算小腸全段長度。計算小腸推進率%(炭墨前沿至幽門括約肌間距(cm)/幽門括約肌至小腸末端間距(cm)×100%)。

  2.3 、統計學分析

  研究數據均采用SPSS 20.0軟件進行統計分析。計量資料如滿足正態檢驗分布且總體方差齊,采用均數±標準差(mean±s)描述,t檢驗進行兩組間均數比較;非正態分布的計量資料組間比較采用非參數秩和檢驗。P<0.05為差異具有統計學意義。

  3 、實驗結果

  3.1、動物一般狀況

  正常組大鼠一般健康狀態良好,飲食正常、活動自如、皮毛光滑,1周后體重增長明顯,二便排泄量及性狀無顯著改變,實驗期間無死亡。模型組大鼠反應遲緩、活動量減少、皮毛疏松,3周后與正常組比較體重減輕,多飲、尿量增多有酮味,糞便外觀改變、糞質稀溏,實驗期間死亡3只。

  3.2、兩組大鼠體重變化比較

  正常組大鼠造模前、造模后1周體重分別為(257.20±8.95)g 和(299.00±17.15)g,體重明顯增加(P<0.01),差異有統計學意義;模型組大鼠造模前、造模后1周體重為(258.60±10.96)g和(292.50±45.95)g,與正常組大鼠相應時間點比較差異無統計學意義(P>0.05);模型組大鼠造模后第3周、第8周體重為(325.00±46.90)g和(366.28±81.37)g,與正常組相應時間點比較體重明顯減輕,差異有統計學意義(P<0.05,P<0.01)(表1,圖1)。

  表1 兩組大鼠造模過程中體重數值(mean±s)
表1 兩組大鼠造模過程中體重數值(mean±s)

  注:*P<0.05,**P<0.01,與正常組比較Note: *P<0.05,**P<0.01, compared with the normal group

  圖1 造模期間兩組大鼠體重變化比較
圖1 造模期間兩組大鼠體重變化比較

  Figure 1 Comparison of body weight changes between two groups during modeling

  3.3、兩組大鼠血糖變化比較

  正常組大鼠造模前與造模后3d時,血糖分別為(6.97±0.49)mmol/L和(7.41±0.51)mmol/L,造模前后血糖水平差異無統計學意義(P>0.05);模型組造模前、造模后3d時,血糖分別為(6.96±0.90)mmol/L和(29.49±6.53)mmol/l,造模后血糖明顯升高(P<0.01),差異有統計學意義;模型組造模后3天與造模8周時,血糖分別為(29.49±6.53)mmol/l與(30.72±7.75)mmol/l,造模過程中血糖水平無顯著性差異(P>0.05);造模后,模型組血糖水平與正常組相應時間點比較明顯升高,差異有統計學意義(P<0.01)。見表2,圖2。

  表2兩組大鼠造模過程中血糖數值(mean±s)
表2兩組大鼠造模過程中血糖數值(mean±s)

  注:*P<0.05,**P<0.01,與正常組比較。Note: *P<0.05,**P<0.01, compared with the normal group.

  圖2 造模期間兩組大鼠空腹血糖變化比較
圖2 造模期間兩組大鼠空腹血糖變化比較

  Figure 2 Comparison of fasting blood glucose changes between two groups of rats during modeling

  3.4、兩組大鼠胃腸動力學指標結果比較

  模型組大鼠胃殘留率為(37.82±5.34)%,與正常組大鼠胃殘留率(23.49±11.54)%比較,模型組大鼠胃殘留率較正常組增加(P<0.05),差異具有統計學意義;模型組大鼠小腸推進率為(54.07±17.94)%,與正常組大鼠小腸推進率(86.53±7.57)%比較,模型組大鼠小腸推進率較正常組明顯降低(P<0.01),差異具有統計學意義(表3)。

  表3兩組大鼠胃腸動力學指標檢測結果(mean±s)
表3兩組大鼠胃腸動力學指標檢測結果(mean±s)

  注:*P<0.05,**P<0.01,與正常組比較Note: *P<0.05,**P<0.01, compared with the normal group

  4、討論

  DGP患者不僅因消化道癥狀使生活質量下降,所患相關疾病的風險增加也會影響患者預后。研究表明,DGP發生腎臟病變風險較胃排空正常的DM患者增加4.3倍,視網膜病變風險增加5.5倍[4]。臨床常在營養評估、控制血糖的基礎上采用促胃腸動力藥、止吐劑等對癥治療,但治療效果有限,長期使用易產生藥物耐受且具有遲發性運動障礙和QT間期延長等不良反應[5],不能持續改善DGP臨床癥狀。因此,亟需建立穩定可靠的動物模型來探討其發病機制和評價藥物治療DGP的臨床療效及安全性。

  目前DGP動物造模方法是在實驗動物形成糖尿病的基礎上,隨病變進展檢測其出現胃腸動力異常而建立的,包括自發糖尿病模型[6]、化學消融胰腺β細胞法[7]、復合因素造模法[8]。自發糖尿病動物模型存在DGP發病不可預測[9]、在無胰島素控制血糖情況下隨訪時間有限[10]、維持成本高等不足,使得該動物模型并非DGP動物造模的首選方法。在DGP動物模型研究中常應用化學消融胰腺β細胞法、復合因素造模法;瘜W消融胰腺β細胞法誘導實驗動物短期內形成糖尿病,出現胃排空延遲,具有建模周期短、操作簡單、成本低的特點。但該造模方法通過直接破壞胰腺β細胞升高血糖,在誘導動物DGP發病過程未涉及胰島素抵抗的病理機制。研究表明,除外高血糖可引起胃竇動力減弱、胃節律不齊而出現胃排空延遲[11],胰島素抵抗或胰島素信號傳導障礙可使Cajal間質細胞數量減少,在DGP發展過程中發揮重要作用[12]。鑒于以上研究結果,較多研究采用復合因素造模法建立DGP動物模型,即在化學消融胰腺β細胞形成高血糖的基礎上聯合高脂高糖飲食誘導胰島素抵抗,以在造模過程中涉及與DGP相關的多種發病因素,生理性模擬DGP發病過程。此造模方法與前述方法比較,相對穩定、費用較低,與DGP發病機制關聯性較高。當前四氧嘧啶(Alloxan)和鏈脲佐菌素(streptozotocin, STZ)是復合因素造模法中常選用的化學消融劑。因Alloxan對動物臟器具有普遍毒性作用,誘導糖尿病的劑量范圍較窄,輕度過量即可產生廣泛毒性作用引起動物高死亡率[13]。STZ通過DNA烷基化介導葡萄糖類似物的毒性作用,發揮其對胰腺β細胞選擇性破壞作用使機體形成DM[14],參與DGP的發生發展。與Alloxan比較,STZ誘導動物造模具有更高的穩定性,動物死亡率低[15] ;此外STZ還可誘導神經元損傷[16],有助于糖尿病動物在病程進展中出現胃動力受損,因而成為誘導實驗動物形成DGP模型的常用藥物,F階段復合因素造模法存在單次大劑量或多次小劑量腹腔注射STZ等不同方法[17,18],且STZ應用劑量、動物造模所需時間[18,19]、評價方法不一致等問題,需進一步探討完善。

  在復習文獻及課題組前期研究[20]基礎上,本研究采用單次50mg/kg STZ腹腔注射結合高脂高糖飼養SD大鼠的方式構建DGP動物模型。結果顯示,模型組大鼠腹腔注射50mg/kg STZ 72h后空腹血糖較正常組顯著升高(P<0.01),且空腹血糖濃度持續≥13.9mmol/L,出現多飲、多尿等與DM患者表現相似的癥狀。3周后體重明顯低于正常組(P<0.05),實驗期間模型組死亡3只,生存率70%,DM誘導成功率達83.3%。配合高脂高糖飼料喂養8周后發現,模型組大鼠較正常組進食量減少,體重降低,大便性狀改變等類似于DGP患者臨床表現。胃腸動力學指標檢測顯示,模型組胃殘留率增加(P<0.05),小腸推進率明顯下降(P < 0.01),表明采用此方法建立DGP模型成功可行。此造模方法簡便易操作,實驗動物DM發病率高,造模期間血糖穩定,動物存活率高,可作為DGP研究的動物模型使用。

  理想的DGP動物模型應具有科學合理可重復、與DGP臨床發病背景相似、能識別DGP潛在發病機制并對治療DGP藥物敏感、可用于后續藥理學篩選及藥物作用機制探討等特點。本研究從實驗動物癥狀、體重、血糖、胃殘留率、小腸推進率等代謝及胃腸動力學功能指標進行了模型初步評價,發現其具有胃排空延遲的病理基礎,可生理性模擬DGP發病背景,與DGP臨床表現相似。目前糖尿病合并胃腸功能障礙評價指標較多,包括胃腸動力學、胃組織電生理學、組織病理學及分子生物學等方面。本研究作為DGP模型的初步探討,采用基礎性胃腸動力學指標驗證模型的可行性,暫未涉及胃組織電生理學、組織病理學及分子生物學等方面的檢測。后續有待進行相關方面研究,開展與DGP發病機制密切相關的自主神經神經病變等方面的研究,以觀察神經病變與DGP動物模型的相關性,進一步深入研究以驗證模型的可行性。同時篩選與胃腸動力障礙密切相關的分子生物標記物,以精確指導DGP大鼠造模進程。此外,由于胃排空過程復雜,需各組分協調完成,目前DGP動物造模以胃排空延遲為主要評價指標,有研究表明DGP患者臨床癥狀并不完全與胃排空延遲有關,因此在動物造模過程中需關注與DGP患者臨床癥狀密切相關的重要發病因素如胃組織協調性(gastric accommodation,GA)等,以建立符合臨床發病特征的動物模型。

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